單細(xì)胞測序3 丨丨文庫構(gòu)建

在本文中你可以學(xué)到什么？

1.DNA片段化/末端修復(fù)/添加A尾（Fragment DNA、End Repair、dA-tailing）

2.接頭連接（ ligation adaptor）

3.PCR富集目的片段（ Sample Index PCR）

4.文庫質(zhì)控（濃度檢測&片段大小檢測）

上期分享了單細(xì)胞測序2 丨丨細(xì)胞捕獲&cDNA擴(kuò)增，主要介紹了單細(xì)胞測序
第二環(huán)節(jié)–基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程：GEMs形成、mRNA逆轉(zhuǎn)錄、二鏈cDNA合成與擴(kuò)增。
接下來進(jìn)入單細(xì)胞測序的第三環(huán)節(jié)–文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建可分為三個(gè)部分：DNA片段化/末端修復(fù)/添加A尾、接頭連接和Index PCR（PCR富集）。

1.DNA片段化/末端修復(fù)/添加A尾

DNA片段化

DNA片段化主要通過物理方法（超聲、加熱）或者酶切的方式將大片段的DNA隨機(jī)打碎成小片段DNA。其中酶切法有一定的偏好性，打斷的DNA片段大小在1kb以下，例如：200bp、350bp、500bp等，但是操作簡單，節(jié)約時(shí)間。

末端修復(fù)

片段化后的DNA鏈存在缺口，兩端均是粘性末端，需要通過末端修復(fù)反應(yīng)，將片段化后的DNA的3’凸端切除，以及將5’凹端補(bǔ)平，轉(zhuǎn)化成含有5′-磷酸基和3′-羥基的平末端DNA。

添加A尾

隨后對DNA的3’末端加dA，轉(zhuǎn)換為粘性末端，用于后續(xù)與adapter互補(bǔ)配對；并對DNA的5’末端進(jìn)行磷酸化。

2.接頭連接

隨后對修復(fù)后的片段進(jìn)行接頭連接，主要是利用DNA連接酶，將3’端帶有dA的DNA片段與adapter接頭進(jìn)行連接。接頭的分類有兩種方式：

單端Index&雙端Index

可根據(jù)Index位置不同，將接頭連接的方式分為單端Index&雙端Index。單端Index指的是構(gòu)建好的文庫序列，僅在P5或P7端存在Index結(jié)構(gòu)； 雙端Index指在P5和P7端都存在Index結(jié)構(gòu)。

長接頭&短接頭

也可根據(jù)接頭是否匹配PCR free建庫的要求，將接頭分為長接頭（完整Y型接頭）和短接頭（非完整Y型接頭）。長接頭包括P5/P7+Index+Read1/Read2序列，可通過TA克隆連接到DNA片段后，形成完整的文庫結(jié)構(gòu)，若文庫產(chǎn)量足量時(shí)，可不進(jìn)行PCR擴(kuò)增直接上機(jī)測序。短接頭只包含Read1/Read2序列，通過TA克隆連接到DNA片段后，需要通過PCR擴(kuò)增將P5/P7和Index序列引入文庫結(jié)構(gòu)中，形成完整的文庫結(jié)構(gòu)后進(jìn)行上機(jī)測序。

3.PCR富集（Sample Index PCR） ??

對接頭連接后DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物含有大量原始模板的正反鏈的Insert Fragment，隨后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，純化后合格的產(chǎn)物可用于高通量測序。

4.文庫質(zhì)控

純化后的PCR產(chǎn)物，需要進(jìn)一步濃度和片段大小檢測。其中濃度能達(dá)到上機(jī)測序要求即可；片段大小必須滿足：片段范圍為300-700bp，主峰在450-550bp；無接頭片段和大片段污染。質(zhì)檢合格的產(chǎn)物可用于高通量測序。

單細(xì)胞平臺-百創(chuàng)DG1000

以下是百創(chuàng)智造公司自主研發(fā)的單細(xì)胞平臺–百創(chuàng)DG1000，百創(chuàng)DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標(biāo)記等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)高通量的細(xì)胞捕獲。除了儀器以外，百創(chuàng)DG1000還有配套的2×4的獨(dú)立芯片、GEM形成試劑盒、純化試劑盒、以及建庫試劑盒。

其中的BMKMANU DG1000 Library Construction Kit是一款針對Illumina高通量測序平臺設(shè)計(jì)的文庫構(gòu)建試劑盒。本試劑盒將cDNA片段化、末端修復(fù)及末端加A尾合并成一步完成，簡化了建庫流程，大大降低了建庫的時(shí)間；且對DNA的片段化是隨機(jī)性的，無明顯堿基偏好性。所得的產(chǎn)物純化后，可通過試劑盒配備的接頭連接試劑，實(shí)現(xiàn)adapter的連接。整個(gè)建庫的流程僅需要~4h，操作簡單方便。

百創(chuàng)DG1000部分?jǐn)?shù)據(jù)展示

【DEMO數(shù)據(jù)】

上周百創(chuàng)智造發(fā)布7個(gè)物種（人、大鼠、雞、鱉、黃顙魚、許氏平鮋、牡蠣）共計(jì)14個(gè)樣品的PBMC數(shù)據(jù)。涵蓋了哺乳動(dòng)物、禽類、爬行、魚類、無脊椎多個(gè)類型的物種。這一發(fā)布成果是國內(nèi)國產(chǎn)單細(xì)胞平臺首次發(fā)布成體系的免費(fèi)PBMC數(shù)據(jù)，可供任何科研人員免費(fèi)下載使用?！炬溄右娢哪?/p>

小鼠睪丸

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小鼠胚胎

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百創(chuàng)智造PBMC數(shù)據(jù)組下載鏈接：

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