單細(xì)胞測(cè)序樣品制備過(guò)程及方法

1.適用范圍

本指南介紹百邁客醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)單細(xì)胞測(cè)序產(chǎn)品的送樣要求及制備過(guò)程方法，采集送樣前請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀。

2.聲明

我國(guó)法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結(jié)膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細(xì)菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國(guó)家的相關(guān)規(guī)定，為嚴(yán)格遵守國(guó)家法律法規(guī)，本著對(duì)社會(huì)及相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)的態(tài)度，我司要求客戶方真實(shí)準(zhǔn)確地提供樣品的生物安全性信息，對(duì)樣品是否含有上述感染性病原體進(jìn)行事先說(shuō)明。樣品中含有上述感染性病原體時(shí)，客戶方需要提供符合生物安全等級(jí)要求的實(shí)驗(yàn)室以便開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，客戶方有義務(wù)協(xié)助我方實(shí)驗(yàn)員做好實(shí)驗(yàn)安全防護(hù)。客戶方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目，已產(chǎn)生的費(fèi)用由客戶方承擔(dān)。如因客戶方提供的生物安全性信息不實(shí)、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實(shí)驗(yàn)員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴(yán)重后果的，我司將按規(guī)定報(bào)告國(guó)家相關(guān)部門，并將通過(guò)法律等手段追究相關(guān)責(zé)任。

目前百邁客單細(xì)胞測(cè)序產(chǎn)品包含：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫(kù)、單細(xì)胞 ATAC、單細(xì)胞多組學(xué) ATAC+GEX，不同類型單細(xì)胞產(chǎn)品具體送樣量要求如下表：

1、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組/單細(xì)胞免疫組庫(kù)

1.1 新鮮組織樣本

1）采集前準(zhǔn)備：

實(shí)驗(yàn)前分別提前 24 小時(shí) 4℃預(yù)冷 4 個(gè)冰袋，-20℃預(yù)冷 2 個(gè)冰袋。

2）組織處理：

A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為 200mg（黃豆粒大?。?；

B.去除周圍的脂肪、結(jié)締組織或者壞死組織，用預(yù)冷的無(wú)菌 PBS 或者生理鹽水清洗 2 遍，清洗掉血水等雜質(zhì)；

C.將清洗干凈的目標(biāo)組織樣本切割成 0.5cm-1cm 左右的組織塊，盡量不超過(guò)1cm，保證組織塊能夠充分接觸組織保存液，完全浸沒(méi)在組織保存液中，快速轉(zhuǎn)移到解離實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行單細(xì)胞懸液制備，或者寄送到百邁客實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行解離。

3）樣本寄送過(guò)程與運(yùn)輸：

A.離心管用 Parafilm 封口膜密封好，在每個(gè)樣品管上清晰、簡(jiǎn)明地標(biāo)記樣品名稱（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機(jī)溶劑接觸），樣品名稱請(qǐng)避免出現(xiàn)漢字，采用字母和數(shù)字表示，長(zhǎng)度控制在 8 個(gè)字符以內(nèi)；

B.樣本管用氣泡膜包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導(dǎo)致組織冰凍而壞死，請(qǐng)根據(jù)運(yùn)輸時(shí)間確認(rèn)冰袋的數(shù)量，確保樣本運(yùn)輸?shù)竭_(dá)目的地時(shí)，樣本溫度保持在2-8℃。

4）注意事項(xiàng)：

A.取樣時(shí)用無(wú)菌手術(shù)刀或剪刀進(jìn)行取樣，如必須用電刀取樣請(qǐng)避免電刀灼燒部位，取樣避免壞死部位，取樣不能有血凝塊；

B.胃癌、胰腺、腦組織等樣本不建議用組織保存液寄送，建議預(yù)約上門實(shí)驗(yàn)，組織保存液適用的具體樣本類型參見(jiàn)第 4.2.2 部分；

C.采樣前可以提前聯(lián)系百邁客當(dāng)?shù)劁N售經(jīng)理獲取組織保護(hù)液，由百邁客實(shí)驗(yàn)室寄送分裝好的組織保存液（美天旎，貨號(hào) 130-100-008），組織保護(hù)液在 2-8℃保存，不建議過(guò)多囤放以防滋生細(xì)菌，使用前觀察試劑狀態(tài)是否為無(wú)色透明液體，無(wú)沉淀、無(wú)異樣；

D.組織在組織保護(hù)液中的最佳儲(chǔ)存時(shí)間為 48h，可維持組織樣本的細(xì)胞活性及完整細(xì)胞表位，具體操作方法可參考《百邁客組織保存液寄樣指南》視頻，可以聯(lián)系百邁客當(dāng)?shù)劁N售經(jīng)理獲取。

送樣不規(guī)范示例：

A.樣本沒(méi)有紗布包裹，與冰袋直接接觸，導(dǎo)致樣本結(jié)冰，解離活率不足；

B.組織太多，占滿整個(gè)管子，組織與保護(hù)液接觸面積很少，使保護(hù)液無(wú)法有效的保持組織活性；

C.樣本結(jié)冰，組織被完全凍住，解離活率很低；

D.未將管口包裹住，樣本運(yùn)輸過(guò)程中管口打開(kāi)，保護(hù)液和部分組織灑落在管外。

1.2血液樣本制備

1）樣本采集：

A.采集新鮮外周血至少 3mL，迅速置于 EDTA 抗凝管（紫色）中保存，取樣完成后需要立即輕柔管上下顛倒采血管 4-6 次，保證 EDTA 抗凝效果；

B.4℃、24h 內(nèi)轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，分離 PBMC 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；

C.或者利用淋巴細(xì)胞分離液分選出外周血單核細(xì)胞 PBMC（分選步驟可參考第5.3.2 部分），加入細(xì)胞凍存液梯度凍存，具體操作見(jiàn)第 3.1.3 部分（推薦上門服務(wù)）；

2）樣本寄送與運(yùn)輸：

A.離心管用 Parafilm 封口膜密封好，在每個(gè)樣品管上清晰、簡(jiǎn)明地標(biāo)記樣品名稱（采用質(zhì)量較好的油性筆，并避免與乙醇等有機(jī)溶劑接觸），樣品名稱請(qǐng)避免

出現(xiàn)漢字，采用字母和數(shù)字表示，長(zhǎng)度控制在 8 個(gè)字符以內(nèi)；

B.樣本管用氣泡膜包裹，避免樣品管直接接觸冰袋而導(dǎo)致組織冰凍而壞死，請(qǐng)根據(jù)運(yùn)輸時(shí)間確認(rèn)冰袋的數(shù)量，確保樣本運(yùn)輸?shù)竭_(dá)目的地時(shí)，樣本溫度保持在2-8℃。

3）注意事項(xiàng)：

A.取樣前需要確認(rèn) EDTA 抗凝管在保質(zhì)期范圍內(nèi)，只能用 EDTA 紫色抗凝管；

B.百邁客可以提供 PBMC 分離服務(wù)；

C.血液離體時(shí)間不超過(guò) 24h。

1.3 PBMC/細(xì)胞懸液樣本制備

PBMC 樣本與細(xì)胞懸液樣本，如果沒(méi)有預(yù)約上門服務(wù)，需要按細(xì)胞梯度凍存的方式凍存起來(lái)，干冰寄送，細(xì)胞梯度凍存操作步驟如下：

A.凍存前準(zhǔn)備：提前 30min 從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復(fù)至室溫備用；

B.準(zhǔn)備好 900μL 血清+100μL DMSO 的細(xì)胞凍存液；

C.收集 PBMC 或細(xì)胞，用預(yù)冷的無(wú)菌 PBS 清洗 1-2 遍，將配好的凍存液進(jìn)行細(xì)胞重懸；

D.將重懸好的細(xì)胞懸液分裝到細(xì)胞凍存管中，并在凍存管側(cè)壁做好標(biāo)記；

E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細(xì)胞在梯度降溫盒中放置 24h 后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進(jìn)行冷凍運(yùn)輸，寄送到百邁客實(shí)驗(yàn)室。

1.4 穿刺樣本制備

1）樣本采集：對(duì)于穿刺樣本，在采集樣本過(guò)程中，使用粗針(穿刺針管外徑≥1.2mm)穿刺采集 3 條樣本。

2）注意事項(xiàng)：

A. 組織處理、樣本寄送與運(yùn)輸參考第 3.1.1 部分；

B. 采集時(shí)需注意的是不能用真空針采樣；

C. 穿刺樣品量較少，建議送樣量≥3 條，通過(guò)增加穿刺樣本數(shù)可以提高成功率。

2、動(dòng)物單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組/單細(xì)胞 ATAC

2.1 冷凍組織樣品

1）樣本采集前準(zhǔn)備：配置 4℃預(yù)冷保護(hù)試劑 2 mL/sample：1.4 mL 1x DPBS+0.6mL甘油，可以減少速凍對(duì)細(xì)胞核質(zhì)量的影響；

2）樣本采集與寄送：

A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為 200mg；

B.去除周圍的脂肪、結(jié)締組織或者壞死組織，用預(yù)冷的無(wú)菌 PBS 或者生理鹽水清洗 2 遍，清洗掉血水等雜質(zhì)；

C.將清洗干凈的目標(biāo)組織樣本放置在預(yù)冷的保護(hù)試劑中剪碎，剪切成約芝麻大小的小顆粒；

D.用移液槍移除保護(hù)試劑，將組織分成兩個(gè)備份，各 100mg，一份提取細(xì)胞核，一份直接提取 RNA（要求 RIN≥7.0）；

E.立即液氮速凍 30min 以上，再轉(zhuǎn)移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實(shí)驗(yàn)室后為冷凍狀態(tài)。

3）注意事項(xiàng)：

心臟、肌肉、皮膚、肺癌、子宮、病變纖維化和器官硬化類組織，提核后會(huì)產(chǎn)生較多的碎片，需要進(jìn)行流式分選去碎片；如果涉及到以上樣本，請(qǐng)送樣前提前告知，以便開(kāi)始提核實(shí)驗(yàn)前預(yù)約好流式細(xì)胞儀，以免耽誤實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。

2.2 凍存細(xì)胞樣本

1）凍存前細(xì)胞質(zhì)檢：凍存前對(duì)細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，要求細(xì)胞活性大于 90%、細(xì)胞結(jié)團(tuán)率小于 10%，樣品無(wú)細(xì)胞碎片等雜質(zhì)；原代細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)大于 1×10 6個(gè)，流式分選細(xì)胞大于 5×10 5個(gè)，并提供質(zhì)檢結(jié)果。

2）細(xì)胞梯度凍存：

A.凍存前準(zhǔn)備：提前 30min 從-80℃冰箱取出梯度降溫盒并恢復(fù)至室溫備用；

B.準(zhǔn)備好 900μL 血清+100μL DMSO 的細(xì)胞凍存液；

C.收集 PBMC 或細(xì)胞，用預(yù)冷的無(wú)菌 PBS 清洗 1-2 遍，將配好的凍存液進(jìn)行細(xì)胞重懸；

D.將重懸好的細(xì)胞懸液分裝到細(xì)胞凍存管中，并在凍存管側(cè)壁做好標(biāo)記；

E.將凍存管放入梯度降溫盒中，放入-80℃冰箱，凍存的細(xì)胞在梯度降溫盒中放置 24h 后可取出放置在液氮保存，或者直接放置在干冰上進(jìn)行冷凍運(yùn)輸，寄送到百邁客實(shí)驗(yàn)室。

2.3 其他類

血液樣本參考第 3.1.2 部分，PBMC/細(xì)胞懸液樣本參考第 3.1.3 部分，推薦直接上門服務(wù)。

3、植物單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組

3.1 新鮮組織樣品

1）活體植株（優(yōu)先推薦）

A.幼嫩植株：種子培育的低齡幼苗（7-14 天）、組培苗——葉片、幼嫩莖、莖尖、根尖；

B.成熟植株：莖尖組織及靠近莖尖的第 1-2 片幼嫩葉片、發(fā)育中的花或者花序；

C.取樣量：保證每一個(gè)單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的理論用量 0.5-2g；

D.其它：特殊貴重活體樣品需要客戶提供樣品的種植、保存條件（溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)液、澆水條件、PH 等等），以保證樣品的正常生長(zhǎng)；

E.每一個(gè)根部保留少量土壤，利用錫箔紙或者塑料薄膜將植株根部包裹起來(lái)，植株部分需要利用小鐵環(huán)或者絲帶纏繞，保證枝條莖葉不分散，但不需要捆綁非常緊實(shí)，防止機(jī)械對(duì)莖枝葉的損傷。

F.外面用紙箱或者泡沫包裹，防止植株碰撞，并用塑料薄膜纏繞固定。

G.一般活體植株常溫運(yùn)輸培養(yǎng)，如果有特殊培養(yǎng)條件（需要做相應(yīng)的處理，例如，低溫用冰袋運(yùn)輸，冰袋與密封袋之間放置泡沫板）。

2）離體枝條

A.枝條選擇：枝條頂端有待萌發(fā)葉芽，且葉芽周邊有幾片幼葉；枝條中下端保留部分成熟葉片；

B.枝條預(yù)處理：剪斷枝條，自底端往上約 5 cm 用浸透水的吸水紙包裹好，放入自封袋，袋中噴水，填充部分空氣，密封袋口;

C.枝條運(yùn)輸：自封袋放入泡沫箱，箱體內(nèi)側(cè)壁放部分冰袋（保證低溫運(yùn)輸），冰袋與自封袋間放置泡沫板，防止冰袋積壓樣品或因冰袋與樣品直接接觸導(dǎo)致樣品被凍傷；

D.運(yùn)輸時(shí)間：保證 24 h 內(nèi)到樣，最多不得超過(guò) 3 天；

E..取樣量：保證每一個(gè)單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的理論用量 0.5-2g；

F.其它：取“離體枝條”僅限比較難以獲得幼嫩活體植株的項(xiàng)目，如野外采樣、植株過(guò)大等導(dǎo)致的取樣或運(yùn)輸比較困難的項(xiàng)目；離體枝條到樣后如有損傷等將不再用于實(shí)驗(yàn)；離體枝條如果保存、運(yùn)輸不善會(huì)存在部分潛在風(fēng)險(xiǎn)：即得到的實(shí)驗(yàn)效果可能會(huì)比活體植株檢測(cè)結(jié)果稍差（理論上的潛在風(fēng)險(xiǎn)）。

3）注意事項(xiàng)

A.建議一次送樣量≥2g；

B.所有待取的幼嫩組織長(zhǎng)勢(shì)必須正常（無(wú)病蟲害、無(wú)營(yíng)養(yǎng)缺失）；

C.對(duì)于需要保留莖尖的特殊情況，取樣時(shí)不取莖尖組織，只取緊靠近莖尖的第1-2 片嫩葉；

3.2 冷凍組織樣品

1）樣本采集前準(zhǔn)備：配置 4℃預(yù)冷保護(hù)試劑 5 mL/sample：1.5 mL 水+2.5 mL 甘油+1 ml FBS，可以減少速凍對(duì)細(xì)胞核質(zhì)量的影響；

2）樣本采集過(guò)程與寄送：

A.新鮮組織從活體取下，要求組織量至少為 400 mg；

B.去除周圍的非目標(biāo)組織，用預(yù)冷的無(wú)菌 PBS 或者生理鹽水清洗 2 遍，清洗掉雜質(zhì)；

C.將清洗干凈的目標(biāo)組織樣本放置在預(yù)冷的保護(hù)試劑中剪碎，剪切成約 0.5 cm3 ,不足 0.5 cm 的從中間切開(kāi)即可；

D.用移液槍移除保護(hù)試劑，將組織分成兩個(gè)備份，其中 300 mg 用來(lái)提取細(xì)胞核，100 mg 用來(lái)提取 RNA（要求 RIN≥7.0）；

E.立即液氮速凍 30min 以上，再轉(zhuǎn)移到-80℃保存或干冰寄送，確保組織寄送到實(shí)驗(yàn)室后為冷凍狀態(tài)。

4、單細(xì)胞多組學(xué) ATAC+GEX

單細(xì)胞多組學(xué) ATAC+GEX 樣本采集、寄送與運(yùn)輸參考第 3.2 部分，但注意送樣量要求和樣本質(zhì)量要求，具體見(jiàn)第 2 部分。

1、懸液制備方案評(píng)估

由于不同物種和組織類型的解離條件差異較大，百邁客提供單細(xì)胞懸液制備預(yù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)，會(huì)對(duì)目標(biāo)組織類型的單細(xì)胞懸液制備方案進(jìn)行評(píng)估。提前預(yù)約好樣本寄送時(shí)間，保證到樣后盡快開(kāi)展單細(xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)，組織凍存液寄送樣本最好在 48h 內(nèi)完成解離；確定好細(xì)胞懸液制備方案后，即可正式開(kāi)展項(xiàng)目。

2、正式實(shí)驗(yàn)

目前百邁客提供兩種類型的正式實(shí)驗(yàn)服務(wù)模式：

2.1 上門服務(wù)

老師只需提供組織樣本，預(yù)約上門后實(shí)驗(yàn)工程師上門，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估的解離方案進(jìn)行解離、單細(xì)胞分選上機(jī)、反轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后低溫暫存，后續(xù)在百邁客實(shí)驗(yàn)室完成建庫(kù)測(cè)序?；蛘呃蠋熗瓿蓡渭?xì)胞懸液制備實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)工程師進(jìn)行單細(xì)胞懸液質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估合格后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作，單細(xì)胞質(zhì)量要求見(jiàn)第 2.2 部分。

備注：單細(xì)胞懸液制備好后，建議在 30 分鐘內(nèi)質(zhì)檢上機(jī)，建議老師提前安排好

時(shí)間；儀器設(shè)備要求詳情見(jiàn)第 4.3.3 部分。

2.2 組織寄送

百邁客單細(xì)胞組織保存液寄送方式（推薦），采用組織保存液儲(chǔ)存組織樣本，既可以保持樣本最原始組織活性狀態(tài)，又可以解決樣本難以獲取以及批次性效應(yīng)等問(wèn)題，老師寄送組織到百邁客實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)工程師進(jìn)行解離、單細(xì)胞分選上機(jī)、反轉(zhuǎn)錄、建庫(kù)、測(cè)序。大部分組織樣本比較合適采取種該方式，但對(duì)于一些特殊組織樣本經(jīng)過(guò)測(cè)試無(wú)法通過(guò)組織保存液儲(chǔ)存保持組織原始狀態(tài)，詳細(xì)樣本類型說(shuō)明見(jiàn)下表：

注意事項(xiàng)

• 根據(jù)組織類型選擇服務(wù)模式：適用于組織保存液寄送的組織推薦組織，寄送，其他不適用寄送的組織類型、細(xì)胞、血液樣本推薦上門服務(wù)；
• 一些特殊樣本由于組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞大小等限制，在不適用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的情況下，可以進(jìn)行單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.3儀器耗材清單

注意事項(xiàng)：

1) 標(biāo)記*的設(shè)備需放置在同一房間；

2) 實(shí)驗(yàn)臺(tái)大小要求能滿足兩名實(shí)驗(yàn)員操作；

3) 三孔儀器電源插座大于 3 個(gè)；

4) 生物安全柜可用常規(guī)實(shí)驗(yàn)臺(tái)代替。

3、風(fēng)險(xiǎn)提示與評(píng)估

1）組織保存液寄送樣本盡量保證 48h 內(nèi)寄送到實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響細(xì)胞活率及細(xì)胞表達(dá)狀態(tài)；

2）單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組組織樣本一定要備份進(jìn)行質(zhì)檢（RIN 值≥7.0），RNA 完整性會(huì)影響數(shù)據(jù)結(jié)果；

3）細(xì)胞活率低于 85%，可能引起 mRNA 部分降解導(dǎo)致基因檢出減少，細(xì)胞內(nèi)線粒體基因比例偏高，占用有效數(shù)據(jù)量；

4）細(xì)胞直徑<40 μm，細(xì)胞過(guò)大容易堵塞芯片，無(wú)法形成油包水，過(guò)大的細(xì)胞利用細(xì)胞篩過(guò)濾；

5）細(xì)胞結(jié)團(tuán)<15%，組織解離不充分，會(huì)看到細(xì)胞懸液中 2 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞粘連在一起的情況，可能會(huì)導(dǎo)致最終數(shù)據(jù)中雙細(xì)胞占比偏多，占用有效數(shù)據(jù)量，結(jié)團(tuán)過(guò)高還可能會(huì)堵塞芯片，無(wú)法形成油包水；

6）解離過(guò)程中可能由于解離條件過(guò)于劇烈而產(chǎn)生大量碎片，可能會(huì)導(dǎo)致背景噪音高，占用有效數(shù)據(jù)量，也會(huì)引起有效細(xì)胞數(shù)偏離預(yù)期。

1、解離酶選擇

根據(jù)具體組織類型選擇對(duì)應(yīng)的酶或酶的組合進(jìn)行解離：

一些常見(jiàn)樣本可以采用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行解離：人腫瘤解離試劑盒，MACS Human Tumor Dissociation kit DS_130-095-929；小鼠腫瘤解離試劑盒，MACS Mouse Tumor Dissociation kit DS_ 130-096-730。

目前文獻(xiàn)已報(bào)到單細(xì)胞組織解離相關(guān)酶推薦:

2、重懸溶液選擇

推薦使用含有 0.04% BSA (400μg/ml)的 1x PBS 溶液(無(wú) Ca 2+和 Mg 2+ ) ，原代細(xì)胞、干細(xì)胞等敏感細(xì)胞類型需要另選擇溶液以保持細(xì)胞活力。已確定以下溶液對(duì)人 293T/17 和小鼠 NIH/3T3 細(xì)胞系的單細(xì)胞解離操作無(wú)影響：

• Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)
• Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)

如果在上述溶液中不能維持細(xì)胞活力，可以用常見(jiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌重懸細(xì)胞。以下培養(yǎng)基已確定對(duì)人 293T/17 和小鼠 NIH/3T3 細(xì)胞系的單細(xì)胞解離操作無(wú)影響：

• Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) + 10% FBS
• Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS
• Iscove’s Modified Eagle Medium (IMEM) + 10% FBS
• Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% FBS
• Ham’s F12 + 10% FBS
• 1:1 DMEM/F12 +10% FBS
• M199

3、單細(xì)胞懸液制備流程參考

3.1 常規(guī)組織解離

a.將拿到的組織樣品在 4℃預(yù)冷的 DPBS 中清洗 2-3 次，轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管中，用 10cm 的手術(shù)剪刀剪成小塊；

b.用自配酶解液或酶解試劑盒在 37℃恒溫水浴鍋或者搖床中孵育，一般樣品解離時(shí)間不超過(guò) 1h；解離過(guò)程中每隔 30min 觀察組織塊的大小、細(xì)胞數(shù)量和活性；一般細(xì)胞數(shù)量達(dá)到 106 個(gè)，消化液渾濁，組織塊消失即可終止孵育；

c.取 40μm 細(xì)胞篩過(guò)濾，組織塊較大也可以先用 100μm/70um 的細(xì)胞過(guò)濾器；

d.一般將細(xì)胞懸液 4℃，300rcf，離心 5min（根據(jù)細(xì)胞大小和數(shù)量調(diào)整離心力和時(shí)間）；

e.棄上清，向上述離心管中加入 1mL 重懸液重懸細(xì)胞；再加入 3mL 預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，吹吸均勻；

f.4℃孵育 5-10min，結(jié)束后立即 4℃，300rcf，離心 5min；

g.去上清，加入 1mL 重懸液充分重懸細(xì)胞；

h.用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀質(zhì)檢，根據(jù)質(zhì)檢結(jié)果調(diào)整濃度，目標(biāo)濃度是 700 – 1200 cell/μL，細(xì)胞活性大于 85%，結(jié)團(tuán)小于 15%；

i.一旦達(dá)到最終的細(xì)胞濃度和活性，將細(xì)胞置于冰上，30min 內(nèi)進(jìn)行 10x 上機(jī)實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)：

• 如果紅細(xì)胞較多可以增加裂紅次數(shù)和時(shí)間；
• 雜質(zhì)較多可以用去碎片試劑盒去除雜質(zhì)；
• 活率較低可以用去死試劑盒移除死細(xì)胞。

3.2、全血分離 PBMC

所需試劑耗材：PBS、Ficoll 或者其他密度梯度分離液、不含鈣鎂離子的 1×PBS+ 0.04% BSA、15 或 50ml 離心管

實(shí)驗(yàn)步驟：將全血用 PBS 1:1 在錐形管中稀釋；在稀釋的樣本上面加入等體積的 Ficoll；1000g 離心 20min；將位于 PBS 和 Ficoll 層間的 PBMC 轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的管中；加入 PBS 清洗細(xì)胞；4℃，300-400g 離心細(xì)胞懸液 4-5min，去除上清液；用不含鈣鎂的 1×PBS + 0.04%BSA 緩沖液重懸沉淀細(xì)胞并做計(jì)數(shù)和活力分析；檢測(cè)合格后，重復(fù)上述離心去上清過(guò)程，將細(xì)胞用不含鈣鎂離子的 1× PBS + 0.04% BSA 緩沖液重懸至細(xì)胞濃度為 700~1200cell/μl。

3.3?培養(yǎng)細(xì)胞

所需試劑耗材：Gibco 0.25% Trypsin-EDTA (1X)、不含鈣鎂離子的 1× PBS +0.04% BSA、15 或 50ml 離心管、細(xì)胞過(guò)濾器

實(shí)驗(yàn)步驟：對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力分析；對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞系，推薦用 0.25% Trypsin-EDTA 酶將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中消化下來(lái)并分離聚集細(xì)胞；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力分析；檢測(cè)合格后，離心去上清，將細(xì)胞用不含鈣鎂離子的 1× PBS + 0.04%BSA 重懸至細(xì)胞濃度為 700~1200cell/μl。

3.4 CD3 +免疫細(xì)胞分選

所需試劑耗材：0.5% v/v FBS + 2 mM EDTA+不含鈣鎂的 1× PBS（PH 7.2）、含 10% FBS DMEM、含 10% FBS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基、Miltenyi 富集分選試劑盒

實(shí)驗(yàn)步驟：從腫瘤組織中解離的腫瘤細(xì)胞在 DMEM（10%FBS）中重懸，進(jìn)行 CD3 細(xì)胞富集實(shí)驗(yàn)，流程針對(duì)的樣本大小適用于 Miltenyi Biotec MS columns；4℃，300rcf 離心 10min，去除上清液，加入預(yù)冷 PBS 溶液混勻；加 CD3 MicroBeads 混勻，4-8℃孵育 15min；重復(fù)離心重懸過(guò)程；將細(xì)胞懸液加入到準(zhǔn)備好的 MS columns 中，2ml 試管收集濾液，陽(yáng)性 CD3+細(xì)胞被留在柱子上，而陰性 CD3-被收集到試管中；拆下柱子，加入 1ml 預(yù)冷 PBS 溶液，利用柱塞將 CD3+細(xì)胞沖洗下來(lái)，收集到 2ml 試管中；離心去除上清液，加入含 10% FBS RPMI 1640 培養(yǎng)基，重懸至細(xì)胞濃度為 700~1200cell/μl。

3.5 腦組織核懸液制備

所需試劑耗材：裂解液（10 mM Tris-HCl+10 mM NaCl+3 mM MgCl2+0.1%Nonidet P40 +無(wú)核酸酶水）、核清洗&重懸 buffer（1%BSA+0.2U/μl RNA 酶抑制劑+1 x PBS、緩沖液（1xPBS + 0.5% BSA）、蔗糖緩沖液（含 300μl Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer 的 2.7 ml Nuclei PURE 2M 蔗糖緩沖液）。

實(shí)驗(yàn)步驟：

a.組織裂解&核清洗（約 45min）

將組織放置在 HEB 培養(yǎng)基中并覆蓋完全，加入 5ml 預(yù)冷裂解液，冰上裂解組織 15min，裂解期間輕柔旋渦搖晃混勻；加入 5ml 的 HEB 培養(yǎng)基，并使用硅化巴斯德移液管將裂解后的組織轉(zhuǎn)移至新的試管中，并吹吸組織 10-15 次，將組織磨碎；使用 30μm 細(xì)胞濾器除去細(xì)胞碎片和團(tuán)塊；4℃，500rcf 離心 5min，除去上清液；加入 10ml buffer，重懸、離心，重復(fù) 2-3 次；使用 30μm 細(xì)胞濾器除去細(xì)胞碎片和團(tuán)塊；4℃，500rcf 離心 5min，除去上清液；加入 1080μl 核清洗&重懸 buffer，輕柔混勻 8-10 次。

b.去除髓磷脂 myelin（約 45min）

加入 120μl myelin Myelin Removal Beads II 重懸核，使用寬口槍頭輕輕混勻；4℃孵育 15min；孵育同時(shí)準(zhǔn)備兩個(gè) LS 柱子和 3ml 緩沖液；孵育完成后，加入5ml buffer 稀釋核懸液，輕輕吹吸 5 次；4℃，500rcf 離心 10min；吸取上清液，加入 2ml buffer 重懸；將重懸液分別加入 1ml 到兩個(gè) LS 柱子中，加入 1ml buffer洗滌柱子兩次，將過(guò)柱液體收集到 5 ml Eppendorf 試管中；4℃，500rcf 離心 5min；除去上清液；加入 500μl 重懸 buffer，輕輕混勻直至核重懸；使用 Countess II FL Automated 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或者血球計(jì)數(shù)板。

c.密度梯度離心（約 1h）

將裝有 500μl 核重懸液的試管，每管加入 900μl 蔗糖緩沖液，輕柔混勻 10次；加入 500μl 蔗糖緩沖液到 2ml 試管中；小心將 1400μl 核重懸液加入試管溶液的表面，不要混勻；4℃，13000rcf 離心 45min；除去上清液，每管留下 100μl，重懸；加入 1ml buffer，輕柔吹吸 8-10 次直至完全混勻；最終理想濃度為 1000個(gè)/μl（1 x 10 6個(gè)/ml）；使用 40μm 細(xì)胞濾器除去細(xì)胞碎片和團(tuán)塊；達(dá)到理想濃度后，將核懸液置于冰上放置，可用于 10x 上機(jī)操作。

3.6 其它文獻(xiàn)參考

• Single-Cell RNA-Seq Reveals the Transcriptional Landscape and Heterogeneityof Aortic Macrophages in Murine Atherosclerosis

正常小鼠和動(dòng)脈粥樣硬化小鼠，收集小鼠主動(dòng)脈的 CD45+細(xì)胞，將小鼠安樂(lè) 死 后 5min 內(nèi) ， 注 射 2μg 偶 聯(lián) 的 大 鼠 抗 小 鼠 CD45.2-APC 或CD45.2-APCefluor780 (eBioscience, clone 104)，并收集小鼠器官。灌注預(yù)冷 PBS，將血液從主動(dòng)脈沖出，分離主動(dòng)脈與血管周圍脂肪組織。切碎動(dòng)脈組織，37℃下RPMI 消化 40min（RPMI 包括 450U/ml 膠原酶 I, 125U/ml 膠原酶 XI 和 60U/ml透明質(zhì)酸酶 ( Sigma Aldrich）。將消化的主動(dòng)脈通過(guò) 40μm 細(xì)胞濾器以獲得單細(xì)胞懸液，10μg/ ml 純化的大鼠抗小鼠 CD16/ CD32（Biolegend）抗體 4℃孵育10min，阻斷非特異性結(jié)合 Fc 受體的抗體。隨后用大鼠抗小鼠 CD45-PE 或CD45-APC(1μg/ml, eBioscience, clone 30-F11)和Fixable Viability Dye eFluor450或eFluor780(1/1000, eBioscience)在 4℃處理 30min。洗滌后重懸，使用流式細(xì)胞儀FACS Aria III（BD Biosciences）分選 CD45 +細(xì)胞后，4％BSA 的 PBS 重懸細(xì)胞。

• Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons

收集小鼠胚胎腦組織，使用木瓜蛋白酶酶解體系（Worthington Biochemical），按照說(shuō)明書將胚胎腦組織解離成細(xì)胞懸液。加入 1mg /ml 的鏈霉蛋白酶（Roche，＃10 165 921 001）后，放置在預(yù)冷的人造腦脊液中，靜置 25min。利用 SonySY3200 sorter 分選細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，準(zhǔn)備上機(jī)建庫(kù)測(cè)序。

• Long-term correction of diabetes in mice by in vivo reprogramming of pancreatic ducts

流式分選肝細(xì)胞：通過(guò)多步膠原酶（XI 型，D 型）灌注法從 MIP-GFP 小鼠中分離出肝細(xì)胞，并用抗體進(jìn)行標(biāo)記。酶灌注后，50g 低速離心 2min 收集肝細(xì)胞，300g 離心 5min 收集肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPC）。抗體標(biāo)記分離的肝細(xì)胞和 NPC，利用 CD31 和 CD45 去除血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。使用 OC2-2F8 和 OC2-2G9 作為肝細(xì)胞表面標(biāo)記物，將 MIC1-1C3 作為肝內(nèi)導(dǎo)管細(xì)胞表面標(biāo)記物。利用 InFlux 細(xì)胞計(jì)數(shù)器（BD Biosciences），基于 GFP 表達(dá)，分選細(xì)胞。

胰腺細(xì)胞的分離：解剖胰臟，預(yù)冷 HBSS 洗滌一次，剪碎，10ml 1mg / ml的 Collagenase P（Sigma-Aldrich）37℃消化 15min，加入 0.1mg / ml 胰蛋白酶抑制劑，降低腺泡細(xì)胞裂解誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率。分離的細(xì)胞用預(yù)冷 DMEM 培養(yǎng)基洗滌 3 次，70μm 過(guò)濾器過(guò)濾，300g 離心 5min。利用偶聯(lián)抗體，4℃，孵育 30min。使用碘化丙啶染色去除死細(xì)胞。利用 FACSCantoII 分析儀或 InFlux 細(xì)胞分選儀（BD Biosciences）分選細(xì)胞。

• Graded Arrays of Spinal and Supraspinal V2a Interneuron Subtypes UnderlieForelimb and Hindlimb Motor Control

分離子宮和腰椎，置于人工腦脊液（aCSF）中，加入 5% Trehalose, 50μM APV和 800μM KA(Worthington Biochemical)，解離細(xì)胞。通過(guò) FACS（FACSDIVA，BD），將宮頸細(xì)胞和腰椎細(xì)胞收集到 500 μL FACS 緩沖(DMEM w/o 酚紅；1 mMEDTA；25 mM HEPES，pH 7.0；5% FBS)中。離心，60 μL FACS 緩沖液重懸，制成單細(xì)胞懸液。

• Conserved properties of dentate gyrus neurogenesis across postnatal developmentrevealed by single-cell RNA sequencing

過(guò)量的異氟烷處死小鼠，人工腦脊液（aCSF）從左心室進(jìn)行心臟灌注。根據(jù)采樣年齡調(diào)整 CaCl2 和 MgSO4 的濃度：小于 P18，每只 2mM；大于 P18，1mMCaCl2 和 7mM MgSO4。aCSF 在使用前在 95%O2、5％CO2中平衡。除酶消化步驟外，細(xì)胞始終 4℃或冰上保存。取出腦部，300μm 震蕩切片機(jī)切片，并顯微切割腦齒狀回區(qū)。使用木瓜蛋白酶試劑盒（Worthington）消化 25-35min，利用涂上 BSA 的 p1000 移液管進(jìn)行人工研磨，制備單細(xì)胞懸液。

• Single-cell profiling of human gliomas reveals macrophage ontogeny as a basis for regional differences in macrophage activation in the tumor microenvironment

手術(shù)切除神經(jīng)膠質(zhì)瘤，用解剖刀將組織在培養(yǎng)基（Leibovitz 的 L-15 培養(yǎng)基，4mg/mL 葡萄糖，100u/mL 青霉素，100ug/mL 鏈霉素）中切碎。加入木瓜蛋白酶（Worthington Biochem.Corp）、含有 2000 units/ mLDNA 酶 I 的EBSS，37℃孵育 30min，解離細(xì)胞。300g，5min 離心后，重懸于 PBS 中。上下移液 10次研磨懸浮液，70μm 過(guò)濾器（BD Falcon）過(guò)濾。300g 離心 5min，PBS 中重懸后，40μm 過(guò)濾器（BD Falcon）過(guò)濾。300g 離心 5min，加入 GNS (Neurocult NS-A )、2 mM 左旋谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 ug/mL 鏈霉素、N2/B27 添加劑（Invitrogen）和丙酮酸鈉重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。

• Molecular Classification and Comparative Taxonomics of Foveal and Peripheral Cells in Primate Retina

用 200 單位的木瓜蛋白酶(Worthington, LS003126)消化猴子視網(wǎng)膜中央凹樣品。M1 和 M2 中央凹在 37℃消化；在 22℃下消化中央凹 M3 和 M4。消化后，視網(wǎng)膜分離，在 Ames 溶液中加入 0.04%的牛血清白蛋白（BSA）制成單細(xì)胞懸液。