腦細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組的單細(xì)胞測序

發(fā)表期刊：Neuron

影響因子：17.173

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2020.12.010

發(fā)表日期：2021-01-06

摘要

單細(xì)胞測序技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組分析，正在改變我們對(duì)神經(jīng)回路的細(xì)胞構(gòu)建模塊的理解。單細(xì)胞測序方法可以通過直接測序數(shù)千到數(shù)百萬單個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)分子信號(hào)，全面表征腦細(xì)胞類型的多樣性。這些測序結(jié)果可以揭示特征細(xì)胞的基因調(diào)控機(jī)制，并提供腦細(xì)胞種群之間發(fā)育和進(jìn)化關(guān)系。單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)可以幫助設(shè)計(jì)用于腦電路組件的目標(biāo)功能研究的工具，將分子特征與解剖學(xué)、連通性、形態(tài)學(xué)和生理學(xué)聯(lián)系起來。在此，作者討論了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀基因在神經(jīng)科學(xué)中的關(guān)鍵應(yīng)用。

前言

腦細(xì)胞是復(fù)雜的生物機(jī)器，其功能是由保守的基因表達(dá)程序在分子水平上定義的。要了解神經(jīng)細(xì)胞類型的分子特征，需要測序數(shù)千個(gè)基因，以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞之間的細(xì)微差別。與此同時(shí)，需要大量的細(xì)胞樣本來捕獲罕見類型并準(zhǔn)確評(píng)估他們之間的差異。對(duì)大量基因的細(xì)粒度分析和對(duì)大量細(xì)胞的覆蓋率的廣度分析常常被視為相互排斥的目標(biāo)：通常情況下，實(shí)驗(yàn)往往是在有限的樣本中檢測盡可能多的分子特征，或在大量樣本中瞄準(zhǔn)少量基因。在本文中，作者對(duì)高通量單細(xì)胞測序分析是如何實(shí)現(xiàn)高分辨率、寬范圍的腦細(xì)胞類型分析進(jìn)行總結(jié)和闡述。
DNA和RNA測序量化信息承載分子編碼并且制定每個(gè)細(xì)胞的生物學(xué)特性。RNA分子的豐度屬于轉(zhuǎn)錄組研究，而DNA和組蛋白的化學(xué)修飾以及細(xì)胞核內(nèi)DNA的物理構(gòu)象則屬于表觀基因組范疇(圖1A)。

圖1：神經(jīng)科學(xué)中的單細(xì)胞測序方法

成千上萬的基因和成千上萬的基因調(diào)控序列之間的相互作用，在每個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生了數(shù)百種的細(xì)胞表型。神經(jīng)科學(xué)家致力于利用細(xì)粒度、大范圍的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)來促進(jìn)對(duì)腦細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組特征的研究。

單細(xì)胞測序樣品的細(xì)胞信息攜帶分子

目前，對(duì)腦組織中RNA和DNA的分析在很大程度上還局限于對(duì)組織平均成分的批量分析。批量分析破壞了轉(zhuǎn)錄本或DNA修飾與單個(gè)細(xì)胞的聯(lián)系，可能無法檢測到罕見的細(xì)胞類型。一種細(xì)胞類型的基因表達(dá)特征可能被其他細(xì)胞類型的互補(bǔ)模式所掩蓋。盡管從特定細(xì)胞群純化整個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞核的技術(shù)可以部分克服這些限制，然而，這需要高度選擇性的RNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記或遺傳工具(如小鼠CRE系)，并且只能應(yīng)用于先前已確定的細(xì)胞類型。

單細(xì)胞測序技術(shù)對(duì)來自單個(gè)細(xì)胞的RNA或DNA進(jìn)行測序，不需要選擇性的細(xì)胞純化。這些技術(shù)可以概括為三個(gè)特征:范圍(細(xì)胞數(shù)量)、粒度(基因或表觀遺傳特征的數(shù)量)和空間分辨率(圖1B)。此外，單細(xì)胞技術(shù)可以檢測不同類型的RNA轉(zhuǎn)錄本或表觀遺傳修飾。雖然單細(xì)胞測序不需要細(xì)胞純化，但它依賴于高質(zhì)量的原組織或冷凍組織。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組由10^5-10^6個(gè)單獨(dú)的信使RNA (mRNA)分子組成。這些信息代表每個(gè)細(xì)胞約4000 ~ 12000個(gè)不同的基因，包括許多編碼基因的多個(gè)變異的不同的mRNA亞型。盡管轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是復(fù)雜的，但細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量與編碼蛋白的豐度相關(guān)，因此是細(xì)胞身份和功能的標(biāo)志。
單細(xì)胞表觀基因組分析方法還可以用于檢測DNA甲基化、染色質(zhì)可及性和染色質(zhì)構(gòu)象等。這些DNA的化學(xué)和物理修飾是在發(fā)育過程中建立起來的，并在整個(gè)生命周期中調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。而轉(zhuǎn)錄組信息表現(xiàn)了基因表達(dá)的差異，部分反映了細(xì)胞的狀態(tài)和組織收集前后神經(jīng)活動(dòng)的影響，表觀遺傳標(biāo)記(包括長壽命染色質(zhì)成分的短暫和穩(wěn)定的修飾)。表觀基因組數(shù)據(jù)還可以解析順式調(diào)控元件的功能，如增強(qiáng)子可以建立和維持細(xì)胞類型特異性的基因表達(dá)。
綜上所述，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組測序共同構(gòu)成了解析大腦細(xì)胞成分的強(qiáng)大工具，使研究健康和疾病大腦中特定細(xì)胞類型的功能成為可能。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)

單細(xì)胞mRNA測序技術(shù)(scRNA-seq)使得腦細(xì)胞類型分子研究進(jìn)入了的新時(shí)代。與常規(guī)的RNA測序(RNA-seq)一樣，scRNA-seq以mRNA分子為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA (cDNA)。二代測序(NGS)文庫是通過cDNA擴(kuò)增、片段化、附加擴(kuò)增和NGS定量等步驟生成的。

多孔板法和液滴法

單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞核可以通過基于多孔板的細(xì)胞分選或液滴分選進(jìn)行物理分離?；诙嗫装宓姆诌x方法使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS) 或顯微鏡引導(dǎo)的毛細(xì)管將單個(gè)細(xì)胞或一組細(xì)胞分布到不同孔中?；谝旱蔚姆椒▽⒓?xì)胞分離到脂質(zhì)懸浮的單個(gè)水室中。細(xì)胞在液滴中被裂解，mRNA分子被逆轉(zhuǎn)錄，并用能識(shí)別細(xì)胞的寡核苷酸條形碼標(biāo)記?；谝旱蔚膕cRNA-seq是高效的，因?yàn)樗姆磻?yīng)體積小，通過微流體裝置的連續(xù)流動(dòng)可以快速處理數(shù)千個(gè)細(xì)胞。

通過物理方式分離細(xì)胞的另一種方法是使用細(xì)胞特異性條形碼組合的cDNA多路測序。一組細(xì)胞被分配到孔中（池化），用特定于孔的條形碼標(biāo)記，然后合并，重新分配到不同的孔中，并用另一種條形碼標(biāo)記。經(jīng)過多次池化、分離和標(biāo)記，細(xì)胞獲得隨機(jī)的條形碼組合?？梢哉{(diào)整每個(gè)孔的單元數(shù)，以確保大多數(shù)單元具有獨(dú)特的條形碼組合，由于條形碼碰撞可能會(huì)發(fā)生一些重疊。然后將來自所有細(xì)胞的cDNA匯集在一起并進(jìn)行測序，然后通過計(jì)算將數(shù)據(jù)解析出來?；诓煌瑮l形碼組合和液滴的方法具有更高的通量和更低的單位細(xì)胞成本，而基于平板的方法提供更敏感的基因檢測和更可定制。
重要的是，這些策略在量化mRNA豐度方面存在差異(圖2A)。基于液滴的scRNA-seq方法計(jì)數(shù)方法對(duì)mRNA分子的5’ 端或3’ 端進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)合獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)(UMIs)，以避免重復(fù)計(jì)數(shù)同一分子的PCR產(chǎn)物。這些數(shù)據(jù)并不能區(qū)分共享相同啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的mRNA異構(gòu)體。相比之下，基于多孔板的分選策略可以對(duì)全長轉(zhuǎn)錄本的片段進(jìn)行測序，包括覆蓋所有表達(dá)外顯子和剪接連接的內(nèi)部片段。這些方法表明mRNA異構(gòu)體的使用在不同的腦細(xì)胞類型中是不同的。通過結(jié)合UMIs的全轉(zhuǎn)錄序列測序，可以在單細(xì)胞中重建數(shù)千個(gè)獨(dú)特的mRNA分子。

圖2：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用

單細(xì)胞和單細(xì)胞核

腦組織中樹突、軸突和膠質(zhì)過程的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)對(duì)scRNA-seq提出了多重挑戰(zhàn)。遠(yuǎn)端細(xì)胞中包含大量的能夠指導(dǎo)合成樹突狀蛋白的mRNA。然而，這些轉(zhuǎn)錄本在解剖和細(xì)胞分離后大部分丟失。因?yàn)樗修D(zhuǎn)錄本都起源于細(xì)胞核，scRNA-seq仍然可以在細(xì)胞核或體細(xì)胞中捕獲新合成的樹突和軸突mRNA，然后將其運(yùn)輸?shù)竭h(yuǎn)端細(xì)胞中。此外，scRNA-seq不能應(yīng)用于冷凍的腦組織，因?yàn)樵诶鋬鲞^程中細(xì)胞膜會(huì)破裂。
另一種方法是單細(xì)胞核測序。核轉(zhuǎn)錄本包含細(xì)胞中的20%-50% RNA，包括未成熟RNA以及未剪接RNA分子(圖2A)。盡管如此，與scRNA-seq相比，snRNA-seq提供了更好的腦細(xì)胞類型標(biāo)記和分辨率。
與scRNA-seq相比，snRNA-seq數(shù)據(jù)可能較少受到某些技術(shù)限制的影響。由于細(xì)胞核的大小和形態(tài)相對(duì)一致，snRNA-seq比scRNAseq更有可能捕獲所有類型的細(xì)胞。此外，在組織剝離和細(xì)胞分離過程中，snRNA-seq不太容易受到虛假的基因表達(dá)激活的影響。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用

細(xì)胞類型定義和表征

單細(xì)胞技術(shù)改變了我們對(duì)腦細(xì)胞種類多樣性的認(rèn)識(shí)。幾十種形態(tài)和功能上截然不同的腦細(xì)胞類型已經(jīng)被確認(rèn)，但是傳統(tǒng)的顯微鏡和生理學(xué)方法對(duì)哺乳動(dòng)物大腦回路中數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞類型進(jìn)行全面表征的范圍有限。最近的scRNA-seq研究在小鼠大腦區(qū)域取樣可以達(dá)到20,000到 750,000個(gè)細(xì)胞。最大的單個(gè)scRNA-seq/snRNA-seq數(shù)據(jù)僅代表了成年小鼠大腦中近1億個(gè)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的1%(圖1B)。
人類大腦的神經(jīng)元細(xì)胞比小鼠大腦多1000倍，全面取樣更令人生畏。來自人類大腦多個(gè)區(qū)域的單核轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)建立了細(xì)胞類型分類(圖2B-2D) 。將人類與小鼠和非人類靈長類動(dòng)物進(jìn)行比較，揭示了保守而獨(dú)特的細(xì)胞類型特征，包括細(xì)胞群體比例的物種特異性差異，以及同源細(xì)胞類別和類型內(nèi)的基因表達(dá)的差異。scRNA-seq/snRNA-seq還提供了對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞多樣性的了解，包括少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系和小膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。
scRNA-seq也被應(yīng)用于非哺乳動(dòng)物的大腦，闡明了關(guān)于發(fā)育、細(xì)胞調(diào)控和衰老的基本問題。例如，衰老極大地減少了果蠅腦細(xì)胞中的RNA數(shù)量。在斑馬魚的大腦中，不同的神經(jīng)干細(xì)胞群體在阿爾茨海默病(AD)模型中受到淀粉樣蛋白毒性的影響不同。

發(fā)展和可塑性

scRNA-seq揭示了小鼠和人類大腦甚至在整個(gè)生物體發(fā)育中的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞類型的發(fā)育。scRNA-seq/snRNA-seq是特別適合研究大腦發(fā)育的方式，因?yàn)殛P(guān)鍵的干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞群可能是短暫的，在沒有事先了解特定分子標(biāo)記的情況下很難分離。scRNA-seq在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)可以重建發(fā)育軌跡，揭示轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)和下游效應(yīng)體調(diào)節(jié)特定的神經(jīng)群體。新生神經(jīng)元和成人少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化軌跡也可以重建。一個(gè)scRNA-seq/snRNA-seq的前沿領(lǐng)域是與人工標(biāo)記的譜系追蹤結(jié)合或與一個(gè)譜系內(nèi)細(xì)胞自然的體細(xì)胞突變相結(jié)合。

除了發(fā)育動(dòng)力學(xué)外，神經(jīng)活動(dòng)和可塑性導(dǎo)致的基因表達(dá)變化可以通過snRNA-seq/scRNA-seq評(píng)估，如視覺皮質(zhì)神經(jīng)元在光照后的表現(xiàn)。此外，分析活性調(diào)節(jié)基因可以識(shí)別活性細(xì)胞?？紤]到活性和鈣信號(hào)依賴的基因調(diào)控在突觸可塑性中的關(guān)鍵作用，體系的背景信號(hào)對(duì)于單細(xì)胞計(jì)數(shù)分辨細(xì)胞類型特異性的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)至關(guān)重要。

細(xì)胞類型在疾病中的作用

通過應(yīng)用于患者死后腦組織的snRNAseq，可以研究疾病的轉(zhuǎn)錄組特征。通過對(duì)48例AD患者的80000個(gè)單核細(xì)胞進(jìn)行snRNA-seq檢測，在單個(gè)細(xì)胞類型中檢測到的差異表達(dá)(DE)基因比在組織中檢測到的多。特別是，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的基因失調(diào)在snRNA-seq中檢測到，但在大量的RNA-seq中沒有檢測到，因?yàn)樯窠?jīng)膠質(zhì)對(duì)組織中總RNA的貢獻(xiàn)相對(duì)較低。snRNA-seq已經(jīng)應(yīng)用于AD、重度抑郁癥、自閉癥、雷特綜合征和多發(fā)性硬化癥等疾病患者的腦組織。
值得注意的是，疾病研究集中在相對(duì)少量的轉(zhuǎn)錄組或表觀基因組簇對(duì)應(yīng)于細(xì)胞類別，而不是單個(gè)類型。解剖細(xì)粒細(xì)胞類型對(duì)疾病的貢獻(xiàn)是重要的，但具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樵谟?jì)算分配單個(gè)細(xì)胞集群的偏差可能會(huì)顯著影響研究結(jié)果。

圖3：單細(xì)胞表觀基因組學(xué)

單細(xì)胞表觀基因組學(xué)

基因的穩(wěn)定表達(dá)部分是通過DNA的表觀遺傳修飾來維持的，如基因組胞嘧啶甲基化和組蛋白的甲基化修飾。這些標(biāo)記通過引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子蛋白與特定基因組區(qū)域的結(jié)合來影響基因表達(dá)，從而增強(qiáng)或降低附近或遠(yuǎn)端基因的轉(zhuǎn)錄。盡管單個(gè)mRNA分子半衰期為幾分鐘到幾小時(shí)，但有絲分裂后的神經(jīng)元中DNA和某些組蛋白的共價(jià)修飾可以持續(xù)數(shù)月到數(shù)年。表觀基因組的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)跨越腦細(xì)胞類型和整個(gè)生命周期，建立和維持細(xì)胞身份，并且可能影響染色質(zhì)可塑性和行為。單細(xì)胞表觀基因組可以補(bǔ)充轉(zhuǎn)錄組，提供細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)調(diào)控的方式。
與snRNA-seq一樣，表觀基因組分析可以應(yīng)用于從冷凍和儲(chǔ)存的死后組織中獲得游離的細(xì)胞核。這些方法可以評(píng)估包括超過95%基因組的非蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。非編碼區(qū)包含數(shù)百萬個(gè)影響基因表達(dá)的候選順勢作用元件(cCREs)，包括啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。cCREs的定義是染色質(zhì)開放區(qū)，DNA甲基化水平低，并且可以通過細(xì)胞核內(nèi)DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)與基因的啟動(dòng)子物理相互作用。識(shí)別細(xì)胞類型特異性的增強(qiáng)子可以指導(dǎo)針對(duì)功能研究細(xì)胞類型的病毒載體和轉(zhuǎn)基因株系的開發(fā)。未來，我們將在單細(xì)胞水平上研究表觀基因組的動(dòng)態(tài)調(diào)控，包括發(fā)育軌跡和學(xué)習(xí)和記憶過程中神經(jīng)元活動(dòng)依賴的基因組修飾。

DNA甲基化

在哺乳動(dòng)物中，基因組胞嘧啶可以被一個(gè)甲基基團(tuán)共價(jià)修飾。甲基胞嘧啶(mC)經(jīng)常在CG雙核苷中被發(fā)現(xiàn)，它經(jīng)常與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。與其他細(xì)胞相比，腦細(xì)胞中的DNA甲基化有兩個(gè)獨(dú)特的特點(diǎn)。首先，神經(jīng)元具有高水平的羥甲基胞嘧啶(hmC)，這是mC的衍生物，可能具有不同的功能。其次，在發(fā)育過程中，神經(jīng)元在非CG位點(diǎn)積累大量mC，(主要是CA和CT二核苷酸)。在整個(gè)基因組中，近10億個(gè)CG和非CG位點(diǎn)的DNA 甲基化修飾(mC)和羥甲基化修飾(hmC)是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中細(xì)胞類型特異性基因調(diào)控的特征。
DNA甲基化可以使用基于多孔板的單個(gè)核分選，然后進(jìn)行DNA的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和測序，每個(gè)細(xì)胞可以捕獲高達(dá)30%的基因組。亞硫酸氫鈉處理可以將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶無法被轉(zhuǎn)化，因此在DNA亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后進(jìn)行測序可以揭示甲基化狀態(tài)胞嘧啶位置。該技術(shù)從45個(gè)小鼠大腦區(qū)域獲得了超過110,000個(gè)單細(xì)胞DNA甲基化信息，在大腦皮層、紋狀體和嗅覺區(qū)域識(shí)別了161個(gè)準(zhǔn)確的神經(jīng)元細(xì)胞類型。每個(gè)神經(jīng)元群體在基因體上都有獨(dú)特的DNA甲基化特征，并且這些特征與基因表達(dá)密切相關(guān)(圖3B)?；谝旱蔚膩喠蛩釟潲}化學(xué)可以潛在地提高單細(xì)胞DNA甲基組分析的效率，但與轉(zhuǎn)錄組測序相比，全基因組測序的高成本仍將是限制該技術(shù)在大量細(xì)胞中應(yīng)用的一個(gè)因素。未來，單細(xì)胞的羥甲基化分析將闡明神經(jīng)元細(xì)胞類型中mC和hmC的相對(duì)數(shù)量。

一維染色質(zhì)可及性圖譜

正如基因是轉(zhuǎn)錄組分析的基本單位一樣，cCREs是表觀基因組分析的基礎(chǔ)。cCREs可以通過與轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合導(dǎo)致核小體移位，形成可及性染色質(zhì)區(qū)域。snATAC-seq可以利用Tn5轉(zhuǎn)座酶捕獲并繪制這些區(qū)域的圖譜。

與scRNA-seq/snRNA-seq一樣，snATAC-seq也可以使用液滴及index組合進(jìn)行分析。snATAC-seq可應(yīng)用于冷凍腦組織，每次實(shí)驗(yàn)可以捕獲大于10^4個(gè)細(xì)胞。值得注意的是，在所有可以在特定細(xì)胞類型中檢測到的遠(yuǎn)端cCREs中，snATAC-seq捕獲大約每個(gè)細(xì)胞的2%-3%。這種較低的覆蓋率可以反映該試驗(yàn)的敏感性，和在同一類型的單個(gè)細(xì)胞間的異質(zhì)性可及性。

盡管覆蓋率較低，snATAC-seq數(shù)據(jù)可靠地準(zhǔn)確區(qū)分了神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞類型。例如，我們使用snATAC確定了160種細(xì)胞類型。在所有類型的細(xì)胞中，總共發(fā)現(xiàn)了50萬個(gè)可達(dá)區(qū)域(cCREs)。另外，在用Tn5轉(zhuǎn)座酶批量標(biāo)記開放的染色質(zhì)后，液滴可用于物理分離細(xì)胞核并進(jìn)行標(biāo)記，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生多達(dá)34,000個(gè)獨(dú)特的測序片段。雖然scRNA-seq/snRNA-seq數(shù)據(jù)需要使用先前注釋過的基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行量化的，但可獲得的染色質(zhì)區(qū)域在整個(gè)基因組中分布，通常無法提前推斷。許多類型的特征已被用于量化snATAC數(shù)據(jù)，包括基因啟動(dòng)子、假定的增強(qiáng)子以及共同DNA序列基序的區(qū)域組合等。每一種方法對(duì)不同的生物信號(hào)都很敏感，并受到片段采樣所引入的背景信號(hào)的不同影響。計(jì)算分析方法的系統(tǒng)基準(zhǔn)和比較對(duì)于實(shí)現(xiàn)最大可能的分辨率很重要。

染色質(zhì)的三維構(gòu)象

CREs和基因啟動(dòng)子通過染色質(zhì)環(huán)和三維結(jié)構(gòu)域相互作用(圖3D)。染色質(zhì)三維構(gòu)象的單細(xì)胞分析與在大量組織中使用的高通量基因組捕獲技術(shù)(Hi-C)密切相關(guān)，通過交叉連接、碎片化和在位置上接近的DNA片段重組，識(shí)別相互作用的區(qū)域。對(duì)得到的文庫進(jìn)行測序可以檢測到嵌合DNA片段，這些片段包含一維基因組中相隔很長一段距離，但它們?cè)谌S空間中緊密相連的序列。這些關(guān)聯(lián)的信息可以用接觸矩陣表示(圖3C)。

染色質(zhì)三維構(gòu)象分析的一個(gè)挑戰(zhàn)是染色體位置之間有很大的空間可以發(fā)生可能的成對(duì)接觸。即使在單細(xì)胞Hi-C實(shí)驗(yàn)中可以捕獲基因組的很大一部分，產(chǎn)生的成對(duì)接觸矩陣也只包含基因組位置三維之間接觸的一小部分，因?yàn)槊總€(gè)DNA片段只能反應(yīng)一次連接事件。單細(xì)胞Hi-C數(shù)據(jù)的聚類分析可以識(shí)別具有相似染色質(zhì)組織的細(xì)胞組，但其本身并不能可靠地區(qū)分皮質(zhì)神經(jīng)元類型。一種替代策略是使用薄的(- 0.2mm)組織切片，然后用激光捕獲單個(gè)核和同一切片中的測序片段。

單細(xì)胞表觀基因組學(xué)的應(yīng)用

解剖神經(jīng)元基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

單細(xì)胞表觀基因組可以用來描述有關(guān)建立和維持腦細(xì)胞類型識(shí)別的轉(zhuǎn)錄因子和cCREs之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。與DNA結(jié)合的蛋白通常識(shí)別6-10個(gè)堿基對(duì)的特定序列或基序(圖3A，Luo 等，2017)。通過檢測cCREs中富集的序列，并與已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序進(jìn)行比較，可以識(shí)別調(diào)節(jié)特定腦細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄因子。該方法應(yīng)用于整合小鼠運(yùn)動(dòng)皮層的多模態(tài)(轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組)數(shù)據(jù)，揭示了轉(zhuǎn)錄因子Rfx3在調(diào)節(jié)興奮神經(jīng)元中的作用。通過檢測結(jié)合位點(diǎn)的染色質(zhì)可及性特征，可以對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的確切位置進(jìn)行高精度分析。然而，到目前為止，這種分析僅限于大量樣本的染色質(zhì)可塑性分析。

遺傳因素與疾病風(fēng)險(xiǎn)的聯(lián)系

盡管全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWASs)已經(jīng)確定了一些神經(jīng)和精神疾病的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，但每種疾病中特定腦細(xì)胞類型的脆弱性在很大程度上仍是未知的。通過細(xì)胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組或表觀基因組的遺傳分析可以識(shí)別活躍基因在GWAS風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)附近富集的細(xì)胞類型，表明其在疾病中可能具有直接或間接的作用(圖3F)。

局限和展望

單細(xì)胞測序正在改變生物學(xué)的許多領(lǐng)域，其影響可能在神經(jīng)科學(xué)方面尤其深刻。腦細(xì)胞類型的多樣性，以及在整個(gè)神經(jīng)元生命周期中細(xì)胞身份和依賴經(jīng)驗(yàn)的可塑性的復(fù)雜調(diào)節(jié)，使得單細(xì)胞分析對(duì)于理解大腦回路至關(guān)重要。

像其他任何新興技術(shù)一樣，單細(xì)胞測序也有重要的局限性。在單孔或液滴中捕獲兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞，或用相同的條形碼標(biāo)記，可能會(huì)使單細(xì)胞數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，并產(chǎn)生虛假的混合細(xì)胞類型。RNA-seq文庫的污染會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。更大的局限性在于假陰性或丟失，因?yàn)椴蓸硬呗酝ǔＶ换謴?fù)總RNA或DNA的一小部分。單細(xì)胞技術(shù)也會(huì)受到組織剝離和細(xì)胞分裂引起的非生理轉(zhuǎn)錄的影響。
單細(xì)胞技術(shù)的一個(gè)更基本的限制是需要破壞細(xì)胞以提取其分子特征以進(jìn)行測序。雖然多組學(xué)和多模態(tài)技術(shù)可以增加每個(gè)細(xì)胞獲得的信息，但這些方法本質(zhì)上是細(xì)胞生命周期的快速捕捉，并沒有記錄對(duì)大腦功能至關(guān)重要的神經(jīng)調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)變化。通過分析成熟和不成熟的RNA轉(zhuǎn)錄本，可以推斷出一些動(dòng)態(tài)信息，但在單細(xì)胞中真正測量轉(zhuǎn)錄組動(dòng)力學(xué)將在大腦相關(guān)的研究中有重要價(jià)值。
單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的復(fù)雜性既是機(jī)遇也是挑戰(zhàn)。用于聚類、可視化和分析單細(xì)胞數(shù)據(jù)的復(fù)雜計(jì)算方法為深入了解細(xì)胞的功能提供了豐富的見解。然而，對(duì)于相同的數(shù)據(jù)，不同的計(jì)算方法或參數(shù)選擇可能導(dǎo)致不同的結(jié)果。聚類程序因其不一致性和缺乏穩(wěn)定性而導(dǎo)致在描述單細(xì)胞數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型方面的主觀性。單細(xì)胞研究必須通過公開透明地調(diào)查和生物學(xué)結(jié)論報(bào)告如何依賴于分析選擇，并公布代碼和數(shù)據(jù)來重現(xiàn)所有分析解決這一問題。

最大的挑戰(zhàn)是將來自單細(xì)胞測序的信息與神經(jīng)元細(xì)胞類型識(shí)別的功能和生理指標(biāo)統(tǒng)一起來。盡管在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)、解剖學(xué)和形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)定義的細(xì)胞類型之間存在顯著的對(duì)應(yīng)關(guān)系，但在數(shù)百種精細(xì)腦細(xì)胞類型水平上協(xié)調(diào)這些數(shù)據(jù)仍處于早期階段。
隨著單細(xì)胞技術(shù)的創(chuàng)新克服了這些挑戰(zhàn)，它們正在為神經(jīng)科學(xué)研究開辟新的前沿領(lǐng)域。單細(xì)胞測序提供了對(duì)多個(gè)物種和不同發(fā)育階段大腦細(xì)胞成分的全面、全腦分析。將單細(xì)胞測序與電生理學(xué)、形態(tài)學(xué)和連通性聯(lián)系起來的技術(shù)將深刻地改變我們對(duì)神經(jīng)元多樣性維度的理解。跨物種和發(fā)育階段的腦細(xì)胞類型的比較將改變我們對(duì)大腦發(fā)生和系統(tǒng)發(fā)育的理解，并可能影響對(duì)神經(jīng)群體間進(jìn)化關(guān)系的詳細(xì)機(jī)制理解。進(jìn)化保守性和分化提供了對(duì)基因調(diào)控程序的深入了解，這些基因調(diào)控程序?qū)σ驗(yàn)樗鼈冋J(rèn)知功能的影響而被選擇。通過結(jié)合單細(xì)胞測序和活性依賴標(biāo)記技術(shù)，神經(jīng)科學(xué)家將能夠?qū)⑥D(zhuǎn)錄組和表觀基因組與特定細(xì)胞類型在行為中的作用聯(lián)系起來。除了技術(shù)進(jìn)步，我們期望新的概念和理論的出現(xiàn)，從而將從單細(xì)胞測序的巨大信息轉(zhuǎn)化為關(guān)于腦細(xì)胞個(gè)體發(fā)生和功能的有組織和系統(tǒng)的知識(shí)。

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