合作文章|單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合多組學(xué)揭示橋本甲狀腺炎與彌漫性甲狀腺腫的疾病微環(huán)境免疫動態(tài)圖譜

少量樣本，實驗只做qPCR驗證，如何發(fā)表8+文章？

今天跟大家分享一篇少量樣本結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析的研究報道，“彌漫性甲狀腺腫和橋本甲狀腺炎微環(huán)境中免疫細(xì)胞基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)”，該文是百邁客合作客戶青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院宋西成教授團(tuán)隊發(fā)表在Frontiers?in?Immunology（IF=8.786）的研究成果，發(fā)表時間為2022年5月。百邁客為該研究提供了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、全轉(zhuǎn)錄組、全長轉(zhuǎn)錄組和代謝組的建庫測序服務(wù)。

研究背景

人類自身免疫性甲狀腺疾病?(AITD)?是最常見的器官特異性自身免疫性疾病，也是甲狀腺功能障礙和非地方性甲狀腺腫的最常見原因，主要表現(xiàn)為彌漫性甲狀腺腫（Graves’disease，GD）和橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s?thyroiditis，HT）；HT和GD具有不同的臨床特征，但它們在組織損傷方面是相似的，包括體內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤。研究表明，T淋巴細(xì)胞及其特異性細(xì)胞因子作為免疫不可或缺的組成部分，在AITD的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和輔助T細(xì)胞17?(Th17)的失調(diào)、Th1/Th2失衡在AITD的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，但這些細(xì)胞亞群免疫功能障礙引起的致病分子機(jī)制在很大程度上仍未得到解釋。

本研究基于HT患者、GD患者和健康對照甲狀腺組織的單細(xì)胞RNA測序、全轉(zhuǎn)錄組測序、ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組測序數(shù)據(jù)，探討了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常的免疫細(xì)胞，構(gòu)建了免疫細(xì)胞的全局調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，為進(jìn)一步了解HT和GD免疫紊亂和代謝異常介導(dǎo)的疾病機(jī)制、更好地干預(yù)和治療疾病提供了科學(xué)的理論指導(dǎo)和研究基礎(chǔ)。

研究思路

主要內(nèi)容

1、全轉(zhuǎn)錄組測序分析HT和GD的異常表達(dá)基因

為了鑒定HT組和GD組中異常表達(dá)的lncRNA和miRNA，分別進(jìn)行了ONT全長轉(zhuǎn)錄組測序和全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)。差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，共檢測到6,153?個?lncRNA?s和?741?個?miRNAs?在?HT?患者中存在差異表達(dá)（圖?1A）；GD患者中檢測到5,492個lncRNAs?和?165?個?miRNAs?存在差異表達(dá)（圖?1B）；相關(guān)性分析結(jié)果驗證了本研究中兩種測序方法的檢測穩(wěn)定性（圖?1C,?D）。

2、HT和GD基因表達(dá)差異與異常免疫級聯(lián)和代謝信號傳導(dǎo)有關(guān)

對HT組和GD組顯著差異基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示，HT組中顯著富集的通路為白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、T?細(xì)胞活化和分化、細(xì)胞因子代謝過程和免疫反應(yīng)激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖?2A），而GD組中，則顯著富集的信號通路為白細(xì)胞-細(xì)胞粘附、激素代謝過程和的細(xì)胞趨化性（圖?2B）；此外，HT（圖?2C）和GD（圖?2D）均富含與甲狀腺疾病相關(guān)的信號通路，包括甲狀旁腺激素合成、甲狀腺激素分泌、甲狀腺激素信號通路作用和自身免疫性甲狀腺疾??；同時，HT和GD還富集了其他幾種免疫炎癥和代謝信號相關(guān)通路，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、NF-kappa?B信號通路、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。

為了進(jìn)一步確定代謝物在HT和GD中的作用，對HT組、GD組及對照組的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異代謝物分析及代謝通路富集分析（圖?2E,?F）。結(jié)果顯示，相較于對照組，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝和類固醇生物合成的代謝通路在HT組中顯著激活（圖?2G(a)），而亞油酸代謝和類固醇激素生物合成代謝通路受到抑制（圖?2G(b)）；此外，類固醇激素生物合成、咖啡因代謝和花生四烯酸代謝通路在GD組中被激活（圖?2G(c)），而苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及亞油酸代謝通路受到抑制（圖?2G(d)）。

鑒于免疫反應(yīng)在HT和GD中的重要作用，利用GSEA方法進(jìn)行免疫浸潤分析，進(jìn)一步評估了樣本中免疫細(xì)胞的豐度，發(fā)現(xiàn)CD4?+T細(xì)胞、CD8?+?T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Th1和Th2細(xì)胞均有不同程度的浸潤（圖?2H）。

3、HT和GD中疾病微環(huán)境中CD4+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常

對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD4+?T細(xì)胞亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?3A）。將bulk?RNA-seq數(shù)據(jù)中顯著差異表達(dá)的基因，與CD4+??T細(xì)胞的單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)中的基因取交集，并對這些共表達(dá)的基因集進(jìn)行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組中顯著差異富集的通路有甲狀腺激素信號通路、T?細(xì)胞受體信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?3B）；而在GD組中，甲狀旁腺激素合成，分泌和作用、ECM-受體相互作用、嘌呤代謝、cAMP?信號通路、NF-kappa?B?信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號通路顯著富集（圖?3C?)。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號通路顯著富集（圖?3D），但GD組中未觀察到顯著富集的通路。此外，氨基酸生物合成和嘌呤代謝相關(guān)的代謝通路在HT和GD組中均顯著富集。

4、HT和GD疾病微環(huán)境中CD8+?T細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常

對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+??T細(xì)胞亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在HT、GD和對照組中細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?4A）；與CD8+?T細(xì)胞亞群類似，將與bulk數(shù)據(jù)中共表達(dá)的基因集進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果顯示，在HT（圖?4B）和GD（圖?4C）中，顯著富集的通路有抗原加工和呈遞、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路；甲狀旁腺激素的合成、分泌和作用及白細(xì)胞跨內(nèi)的遷移途徑在HT組顯著富集；而GD組中，嘌呤代謝和cAMP信號通路顯著富集。GSEA分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和?NF-kappa?B?信號通路顯著富集（圖?4D），而在GD組中未發(fā)現(xiàn)顯著富集的通路；嘌呤代謝信號通路在HT組和GD組中均富集。

5、HT和GD微環(huán)境巨噬細(xì)胞中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常

對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的CD8+?T細(xì)胞亞群進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)?HT、GD?和對照組中巨噬細(xì)胞豐度存在明顯差異（圖?5A）。同樣地，將與bulk數(shù)據(jù)共表達(dá)的基因集進(jìn)行功能富集分析；分析結(jié)果顯示，HT組（圖?5B）和GD組（圖?5C）顯著富集的信號通路有甲狀旁腺激素的合成，分泌和作用、抗原加工和呈遞、Th1和Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化、NOD樣受體信號通路、NF-kappa?B信號通路和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用；T組中，甲狀腺激素信號通路和Toll樣受體信號通路顯著富集；GD組中，吞噬體、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑顯著富集。GSEA富集分析結(jié)果顯示，HT組中細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、NF-kappa?B信號通路、Th1和Th2細(xì)胞分化以及Th17細(xì)胞分化通路顯著富集（圖?5D)，而GD組中沒有發(fā)現(xiàn)類似的富集通路；嘌呤和苯丙氨酸代謝信號通路分別在HT組和GD組中顯著富集。

 

6、HT和GD微環(huán)境中T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

為了確定HT和GD疾病微環(huán)境的細(xì)胞間調(diào)節(jié)機(jī)制，對CD4+?T細(xì)胞、CD8+?T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行iTALK細(xì)胞通訊分析。分析結(jié)果顯示，HT（圖?6A）和GD（圖?6B）中配體-受體對的豐度存在顯著差異；HT組中，微環(huán)境中的T細(xì)胞主要通過IL16-CCR5、FGF10-FGFR1、CXCL13-CXCR3和CD70-CD27受體配體對靶向巨噬細(xì)胞，激活細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和T細(xì)胞受體信號通路（圖?6C）；GD組中，微環(huán)境T細(xì)胞主要通過CXCR3-CXCL10、PKM-CD44和?CCL21-CCR7受體配體對靶向巨噬細(xì)胞，激活EMC受體相互作用和NF-kappa?B信號通路（圖?6D）；相較于對照相，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因（CCL21、CCR7、CD4、CD27、CD70、CXCL13、ICOS、IL-16、LAT、TNF及IL16），經(jīng)qPCR實驗驗證，在HT組?(圖?6E?)?和GD?(圖?6F?)均顯示存在顯著差異表達(dá)。

 

研究小結(jié)

本研究利用轉(zhuǎn)錄水平和代謝水平的測序數(shù)據(jù)聯(lián)合，在單細(xì)胞水平上鑒定了HT和GD疾病微環(huán)境中基因表達(dá)失調(diào)和代謝信號異常的免疫細(xì)胞；同時，構(gòu)建了免疫細(xì)胞的全局調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為HT和GD疾病機(jī)制介導(dǎo)的免疫失調(diào)和代謝異常提供了新的視角。

參考文獻(xiàn)

Zheng,?Haitao?et?al.?“A?Global?Regulatory?Network?for?Dysregulated?Gene?Expression?and?Abnormal?Metabolic?Signaling?in?Immune?Cells?in?the?Microenvironment?of?Graves’?Disease?and?Hashimoto’s?Thyroiditis.”?Frontiers?in?immunology?vol.?13?879824.?26?May.?2022,?doi:10.3389/fimmu.2022.879824