在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炛?，需要從各種樣本中制備單細(xì)胞懸液，針對不同的樣本類型，如何獲取活性高、完整性好、結(jié)團(tuán)率低的單細(xì)胞懸浮液，是單細(xì)胞實驗成功與否的關(guān)鍵所在。下面就分享從動物組織、血液、植物組織三種樣本中獲取單細(xì)胞懸浮液的基本制備方法和注意事項。
一、動物組織
動物組織由細(xì)胞外基質(zhì)和嵌入細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞組成，且細(xì)胞和細(xì)胞之間存在著大量的蛋白質(zhì)，例如增強(qiáng)組織強(qiáng)度和韌性的膠原蛋白、彈性蛋白等；促使細(xì)胞和外基質(zhì)結(jié)合的層黏連蛋白、纖黏連蛋白等。一般需要通過機(jī)械法或者酶解法得到單細(xì)胞懸浮液。
不同的組織類型需要不同的解離酶混合液，目前常用的有膠原酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等，將動物組織解離成單細(xì)胞懸浮液。根據(jù)具體組織類型選擇對應(yīng)的酶或酶的組合進(jìn)行解離。
動物組織解離需要注意：
1、細(xì)胞離開母體后很脆弱，解離過程中酶混合液配比、酶濃度、離心速度、孵育溫度、緩沖液等都可能影響細(xì)胞活性。
2、對于難解離的樣本，需要優(yōu)化解離酶混合液的配比和延長解離時間。
3、新鮮的組織才能用于單細(xì)胞懸浮液的制備，若是冰凍動物組織建議提取細(xì)胞核。
4、組織解離過程中，若細(xì)胞碎片過多，會大大降低細(xì)胞的捕獲效率。
二、血液樣本
外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood monoculear cell, PBMC)中大部分都是淋巴細(xì)胞（包括B細(xì)胞和T細(xì)胞)，以及少部分的自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞，而紅細(xì)胞和血小板沒有細(xì)胞核，而粒細(xì)胞(granulocytes) 包括中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，有多葉核，所以不包括在PBMC中。PBMC的制備采用密度梯度離心法，可通過Ficoll作為密度梯度介，使得不同密度的細(xì)胞在對應(yīng)的界面處，然后通過快速離心，實現(xiàn)細(xì)胞分離。
圖1. Ficoll分離細(xì)胞的原理效果圖（圖片來自于網(wǎng)絡(luò)）
制備PBMC需要注意：
1、全血分離人PBMC，血液樣本置于EDTA紫色抗凝管中保存，4℃保存不超過12h。
2、需緩慢將血液加在Ficoll上層，速度過快可能會沖破層界。
3、使用前需要將Ficoll溶液先恢復(fù)至室溫，再進(jìn)行后續(xù)實驗。
4、搜集得到的樣本若還含有大量的紅細(xì)胞，需要進(jìn)行二次裂紅處理。
三、植物組織
近年來，關(guān)于人和動物的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序應(yīng)用越來越廣泛，植物單細(xì)胞研究相對滯后且應(yīng)用領(lǐng)域范圍較小。因為與動物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞多了一層細(xì)胞壁，阻礙了植物單細(xì)胞懸浮液的制備。一般需要通過酶解法將植物組織制備成原生質(zhì)體，例如用纖維素酶以及果膠酶消化植物細(xì)胞壁的主要成分（纖維素、半纖維素、果膠等）。
原生質(zhì)體制備需要注意：
1、幼嫩的組織，比如根尖、嫩葉等，細(xì)胞壁比較容易被酶消化。成熟或衰老組織需更長酶解時間，以便增加原生質(zhì)體的獲得率。
2、為了提高原生質(zhì)體的制備率，建議PH的范圍維持在5.6～6.0。
3、一般選用0.4M的甘露醇穩(wěn)定劑來維持滲透壓的平衡。
4.對于一些難制備原生質(zhì)體的植物樣本，可以考慮提取植物細(xì)胞核。
最后，制備合格的單細(xì)胞懸浮液/原生質(zhì)體/細(xì)胞核樣本，可以直接通過百創(chuàng)DG1000單細(xì)胞微液滴系統(tǒng)，實現(xiàn)高通量的單細(xì)胞精準(zhǔn)捕獲。百創(chuàng)DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標(biāo)記等技術(shù)來實現(xiàn)高通量的細(xì)胞捕獲。除了儀器以外，百創(chuàng)DG1000還有配套的2×4的獨(dú)立芯片及配套試劑盒。
百創(chuàng)DG1000部分?jǐn)?shù)據(jù)展示
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