單細胞精準捕獲技術介紹

單細胞測序中，從樣本制備到文庫測序要經(jīng)過5個技術流程：單細胞懸液制備、單細胞精準捕獲&cDNA擴增、文庫構建、上機測序、以及數(shù)據(jù)分析步驟。上期分享了單細胞測序1丨單細胞懸浮液制備，主要介紹了從動物組織、血液、植物組織三種樣本中獲取單細胞懸浮液的基本方法和注意事項。接下來分享：如何精準捕獲單細胞&cDNA擴增等。

目前常見的捕獲單細胞技術方法有：微流控和微孔板法。本文通過基于微流控法的平臺-百創(chuàng)DG1000來精準捕獲細胞，并進行后續(xù)的逆轉錄、cDNA合成與擴增、文庫構建等實驗，從而獲得每個細胞的轉錄組信息。

1、芯片加樣

處理好的細胞懸液盡量在30min以內(nèi)上機實驗，長時間放置，會導致細胞活性降低。按照一定的加樣順序，分別將細胞相、膠珠相（DG1000-3′ gel beads）、油相加入到芯片（圖1:左圖）對應孔中，然后將芯片放入到百創(chuàng)DG1000微液滴生成儀中（圖1:右圖），啟動開關。

2、形成GEMs

儀器運行后，通過控制流速的方法，使得在“Y型”接口處，一個膠珠會吸附單個細胞及逆轉錄預混液一起向右流動。到了“十字”接口處，它們與油相接觸后，每一個油滴中會包裹著一個膠珠與一個細胞，也就是“油包水”（GEMs）結構。

引物結構

• 百創(chuàng)DG1000-3′ gel beads（膠珠）上固定的引物由4部分組成 ：Read1、Cell Barcode、UMI、Poly(dT)VN。
• Read 1: 是一段已知的短核昔酸序列,主要用于后續(xù)的上機測序
• Cell Barcode：片段長度54bp，種類約為88萬種，一個膠珠對應于一個特異Cell Barcode序列。
• UMI：在 mRNA反轉錄后，每一個mRNA隨機連上一個UMI，可以通過計數(shù)不同的UMI，最終確定mRNA的數(shù)量。
• Polv(dT)VN:與mRNA3’端的poly(A)結合,進行后續(xù)的逆轉錄反應

3、cDNA生成與擴增

GEMs形成后，細胞裂解釋放出mRNA；同時膠珠也會自動溶解，釋放出大量含有Barcode序列的引物，并利用引物末端的Ploy(dT)VN序列捕獲液滴中的mRNA，并在一個個GEM中獨立完成mRNA逆轉錄，產(chǎn)生帶有Barcode和UMI信息的cDNA。隨后“油包水”結構裂開，進行cDNA擴增。

將擴增得到的cDNA純化后，可用于后續(xù)構建測序文庫。由于每一個單細胞的cDNA文庫標記上了細胞條形碼（Barcode）。測序時，就把攜帶相同Barcode的序列視為來自同一個細胞，達到區(qū)分細胞的目的。

以上就是生成GEMs、mRNA逆轉錄、以及cDNA合成與擴增的全部內(nèi)容。下期會具體介紹數(shù)據(jù)分析指標的意義。

單細胞平臺-百創(chuàng)DG1000

百創(chuàng)DG1000是基于微流控、油滴包裹和Barcode標記等技術來實現(xiàn)高通量的單細胞精準捕獲。除了儀器以外，百創(chuàng)DG1000還有配套的2×4的獨立芯片及配套試劑盒。

百創(chuàng)DG1000部分數(shù)據(jù)展示

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