PCR（polymerase chain reaction）擴(kuò)增目的片段→電泳（electrophoresis）→純化（purification）→連接 (ligase )→轉(zhuǎn)化(transformation)→陽(yáng)性克隆(positive clone)→檢測(cè)(detection)
圖1：無(wú)縫克隆流程圖（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
2. PCR擴(kuò)增：選擇要擴(kuò)增的目的片段，在正義鏈和反義鏈的末端分別設(shè)計(jì)一條帶有線性化載體正義鏈和反義鏈部分同源序列一致的引物，此處參考說明書建議（15-25bp）。為了減少非特異性擴(kuò)增，建議與靶序列的匹配度越高越好。
3.電泳：PCR結(jié)果的好壞通常通過瓊脂糖凝膠電泳來觀察條帶有無(wú)或者濃度大小，基本原理是瓊脂糖凝膠介質(zhì)中添加了在紫外下可以顯色的EB, 這種試劑可以嵌合到核酸分子中，與DNA雙鏈結(jié)合，因此，分子量越大的DNA分子，顯色度越高，在相同濃度下也越亮。有的時(shí)候如果分子量很小的DNA, 濃度又不高的情況下，DNA條帶有可能會(huì)出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。
4.目的片段的純化（膠回收）：PCR擴(kuò)增結(jié)束后，體系中可能會(huì)有未參與反應(yīng)的聚合酶，Mg2+等，所以一般是建議通過純化的步驟將這些雜質(zhì)去除，以利于后續(xù)反應(yīng)的穩(wěn)定進(jìn)行。
載體線性化：目的片段插入需要將環(huán)狀的質(zhì)粒用酶來消化成線性的雙鏈DNA分子，實(shí)際情況下載體消化會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間和酶量多少而有較大區(qū)別，如果用于后續(xù)的基因克隆，建議消化盡量完全。
5.連接反應(yīng)：Biomarker MultiF Seamless Assembly Mix試劑盒可以將多個(gè)片段組合到載體上，形成一個(gè)環(huán)狀的重組質(zhì)粒。用于后續(xù)的建庫(kù)測(cè)序或者誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。
6.轉(zhuǎn)化：基本原理是質(zhì)粒容易在大腸桿菌中穩(wěn)定繁殖，這部分是基因克隆的關(guān)鍵，如果成功，后續(xù)的平板上會(huì)有單克隆的出現(xiàn)。有單克隆出現(xiàn)可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。單克隆平板可以在4 ℃冰箱存放一個(gè)月，仍然不失效。
7.檢測(cè)：挑取帶有抗生素平板單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，3-4 h, 使質(zhì)?？截悢?shù)增加，隨后用于菌落PCR檢測(cè)，是否是插入了目標(biāo)片段的質(zhì)粒。
小貼士
其他判斷陽(yáng)性單克隆的方法？
最可靠的方法是酶切，一個(gè)環(huán)狀重組質(zhì)粒，在對(duì)應(yīng)的位置用限制性內(nèi)切酶雙酶切后，會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)目的片段，如果不能出現(xiàn)兩個(gè)片段，一般可以認(rèn)為是空載體沒有線性消化完全。
結(jié)果展示
圖2：?jiǎn)慰寺z測(cè)示意圖
結(jié)果分析
攜帶有目的片段的質(zhì)粒能夠抵抗抗生素，才使得在平板培養(yǎng)基上長(zhǎng)出來。但也有可能是沒有消化完全的空質(zhì)粒。因此，下一步的鑒定實(shí)驗(yàn)顯得尤為重要。菌落PCR在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，容易有假陽(yáng)性出現(xiàn)，可能的原因很多，因此，最根本的方法就是提高陽(yáng)性率。以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物濃度會(huì)很高，可作為判定假陽(yáng)性的一個(gè)依據(jù)。以及上述所提及的質(zhì)粒的酶切，都是最常用的方法。
保存條件
產(chǎn)品應(yīng)用
DNA定點(diǎn)突變
相關(guān)產(chǎn)品
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