亚洲AV无码乱码在线观看性色,内捧疯狂进出免费视频

發(fā)布于 2021年12月22日

分類(lèi)：智能制造

1.多糖多酚中的RNA為什么難提??？

從多糖多酚植物樣本中，如何提取到質(zhì)量較好的RNA，是許多科研人員最頭疼的事情，因?yàn)槎嗵嵌喾訒?huì)降低RNA提取純度&濃度。常見(jiàn)的水果如蘋(píng)果、柑橘、草莓、樹(shù)莓、葡萄；常見(jiàn)的農(nóng)作物如馬鈴薯、煙草、棉花等；中草藥如半夏、石斛、靈芝等，都含有大量的多糖多酚。那么為什么多糖多酚植物RNA較難提取呢？具體原因有3點(diǎn)：

1.RNA為單鏈結(jié)構(gòu)，易降解，且含有2’-OH基團(tuán)，易發(fā)生氧化還原反應(yīng)，分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。

2.遍布各處的RNase（RNA水解酶）能催化RNA降解，且酶活高不易清除。

3.部分植物樣本富含多糖、多酚，或含有某些尚無(wú)法確定的次級(jí)代謝產(chǎn)物,干擾RNA的質(zhì)量。

多糖：其理化性質(zhì)與RNA相似，在去除多糖過(guò)程中會(huì)裹挾大量的RNA，導(dǎo)致RNA的得率降低；同時(shí)在RNA沉淀過(guò)程中，多糖也會(huì)和RNA形成凝膠沉淀，導(dǎo)致RNA純度過(guò)低；多糖還會(huì)影響一些酶的活性，降低建庫(kù)成功率。

酚類(lèi)：細(xì)胞裂解后，酚類(lèi)化合物遇空氣極易氧化成醌類(lèi)。與RNA不可逆結(jié)合，從而影響其純度。越成熟的組織酚類(lèi)含量越高，幼嫩組織提取難度較小。

[注意]：在裂解液中加入抗氧化劑，可抑制RNase酶活性，并減輕酚類(lèi)物質(zhì)的影響。

次級(jí)代謝產(chǎn)物：成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，易與RNA結(jié)合，降低RNA提取的質(zhì)量。

2.RNA提取方法

目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的提取RNA的方法，包括Trizol法、SDS-苯酚法、試劑盒法等。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，具體如下：

（一）TRIzol法

TRIzol主要成分：苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白、核酸物質(zhì)解聚得到釋放。異硫氰酸胍是強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，釋放出核酸。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、RNA提取完整性好、適用于一些次生代謝物含量少的植物組織。

缺點(diǎn)：苯酚不能完全抑制RNAse活性，完成RNA部分損失。

（二）SDS-苯酚法

SDS和苯酚能夠使蛋白質(zhì)變性、抑制內(nèi)源性RNase的活性，同時(shí)裂解細(xì)胞膜，釋放出所需要的RNA。而且苯酚可以將溶液中蛋白質(zhì)、多糖、DNA 分層到有機(jī)相中，而RNA則留在上清溶液中。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力。

缺點(diǎn)：提取過(guò)程中，無(wú)法清除大量的多糖多酚，導(dǎo)致提取的RNA純度降低，無(wú)法保證后續(xù)建庫(kù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的進(jìn)行。

（三）試劑盒法

目前市場(chǎng)上有許多專(zhuān)門(mén)用于多糖多酚植物RNA提取試劑盒，試劑盒中的裂解液可以裂解植物樣本，鹽酸胍抑制RNase的活性；β-巰基乙醇抑制RNase的活性同時(shí)使蛋白變性，最后通過(guò)離心柱上的吸附膜，特異性吸附RNA。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快捷、不需要加入氯仿等有機(jī)溶劑；RNA純度高，適用于下游定量、建庫(kù)、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。

缺點(diǎn)：必須是新鮮或者未反復(fù)凍融的植物樣本；提取操作不當(dāng)，可能會(huì)堵塞濾膜。

3.RNA質(zhì)量檢測(cè)

提取完RNA后，都要進(jìn)行一系列的質(zhì)量驗(yàn)證，質(zhì)量合格的RNA，才能用于后續(xù)的建庫(kù)、測(cè)序、熒光定量等實(shí)驗(yàn)。一般需要對(duì)RNA的濃度、純度、完整性進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)方法&標(biāo)準(zhǔn)如下：

1.RNA濃度&純度檢測(cè)：一般需要通過(guò)紫外分光光度計(jì)，檢測(cè)RNA在260 nm的吸光度。純RNA：OD260/OD280≈2.0

表1：通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度

2.完整性檢測(cè)：可以通過(guò)凝膠電泳法和檢測(cè)RIN值，來(lái)判斷RNA的完整性。凝膠電泳法真核生物RNA進(jìn)行跑膠后，有三個(gè)亮度不一樣的條帶，分別是28S、18S、5S。一般28S條帶最亮，18S次之，5S條帶最弱甚至看不見(jiàn)。若28S條帶的亮度大概是18S條帶的兩倍或者以上，這種情況RNA的質(zhì)量是很好的。如下圖所示

圖1：凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性（圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)）。

3.Agilent 2100儀器檢測(cè)RIN值

RNA Integrity Number （RIN）值大小反映了RNA的完整性，一般認(rèn)為RIN值范圍為6.3-10.0，就說(shuō)明RNA完整。RIN值越接近10，表明RNA完整性越好，反之完整性越（特殊樣品需結(jié)合基線綜合評(píng)估）。Agilent 2100儀器不僅可以檢測(cè)RIN值，還可以得到RNA的濃度和28S/18S比值（原核生物為23S/16S）。

圖2：RIN值參考值。

4.多糖多酚植物RNA提取試劑盒

針對(duì)復(fù)雜植物RNA提取，使用百邁客生物公司研發(fā)的多糖多酚植物RNA提取試劑盒（貨號(hào)：RK02004），采用獨(dú)特的裂解液，以及高效基因組DNA柱清除技術(shù)，可以將多糖多酚清除掉，且無(wú)需添加氯仿、苯酚，30~40 min即可獲得高純度、高濃度的RNA。

1.部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)